Human DLPFC Visium 空间转录组分析

作者

Dayou Zou

发布于

2026年5月26日

1 引言

1.1 数据背景

人脑 dorsolateral prefrontal cortex（DLPFC）具有清晰的皮层层状结构。10x Visium 空间转录组数据在保留组织空间位置的同时测量 spot-level RNA 表达，因此适合用于检查空间表达模式、皮层层次相关 marker，以及不同空间聚类方法对层状结构的识别能力。

本项目使用 Maynard et al. 发布的 human DLPFC Visium 数据，分析对象为 sample 151673。该样本包含人工标注的 Layer1–Layer6 和 white matter（WM），因此可以作为一个小型 benchmark，用于比较无监督聚类结果与专家层注释的一致性。

1.2 项目目标

本项目侧重分析流程和方法比较，分析包括五个部分：

对 spot-level 表达矩阵进行 QC、归一化、HVG 选择、PCA 和表达图构建；
使用 Moran’s I 识别空间可变基因，并检查已知皮层/WM marker 的空间分布；
比较 Leiden、SpaGCN 和 BayesSpace 三种聚类结果与人工层注释的一致性；
以 human MTG snRNA-seq 作为参考，通过 Tangram 反卷积估计主要细胞类型的空间趋势；
使用 neighborhood enrichment、co-occurrence 和 Ripley’s L 检查空间邻域关系。

人工层注释不参与无监督聚类模型拟合，主要用于后续评估不同方法与皮层层状结构的一致性。Leiden resolution、SpaGCN n_clusters 和 BayesSpace q 的设置参考了 7 个专家标注区域，因此本报告的聚类比较应理解为固定目标类数附近的 benchmark，而不是完全无约束的模型选择。

1.3 数据概况

本分析使用 sample 151673 的公开 Space Ranger 输出矩阵和对应的人工层注释。原始读取后共有 3,639 个 spot 和 33,538 个基因；其中 3,611 个 spot 带有人工层注释。去除没有层注释的 spot 后，Layer1–Layer6 和 WM 均保留在分析中。

表 1: 人工层注释的 spot 组成

区域	spot 数
Layer1	273
Layer2	253
Layer3	989
Layer4	218
Layer5	673
Layer6	692
WM	513
合计	3,611

2 质量控制

质量控制在 spot 层面进行，主要检查 total_counts、n_genes_by_counts 和 pct_counts_mt。过滤前，带人工层注释的 spot 数为 3,611。过滤条件为 min_counts >= 500、min_genes >= 200 和 pct_counts_mt < 30；同时去除在少于 10 个 spot 中检出的基因。过滤后保留 3,601 个 spot 和 16,567 个基因。

图 1 展示三个主要 QC 指标的空间分布。Gray matter 区域整体显示较高的 UMI 和检测基因数；pct_counts_mt 未显示明显局部集中升高。本项目未使用多样本或外部 QC 对照，因此这里仅将 QC 结果作为后续分析的基本过滤依据。

表 2: QC 前后的数据规模变化

阶段	spot 数	基因数
原始读取	3,639	33,538
带人工层注释	3,611	33,538
QC 后	3,601	16,567

图 2 显示 sample 151673 的人工层注释。该注释用于后续聚类结果评估，不作为 Leiden、SpaGCN 或 BayesSpace 的训练标签。

3 空间表达结构

3.1 预处理与表达聚类 baseline

QC 后的矩阵使用 target_sum=10,000 做 library size normalization，并进行 log1p 转换。HVG 选择使用 seurat_v3 方法，保留 3,000 个高变基因。PCA 在 HVG 上计算 50 个主成分，后续 kNN 图构建使用前 17 个 PC。

Leiden 聚类作为不显式使用空间坐标的表达聚类 baseline。这里的 baseline 用于和 SpaGCN、BayesSpace 这类空间方法对比，而不是作为最终层注释结果。

表 3: 预处理和表达聚类参数

步骤	设置
Normalization	`target_sum=10,000`
Transformation	`log1p`
HVG	`seurat_v3`, `n_top_genes=3,000`
PCA	50 PCs
kNN graph	`n_neighbors=15`, `n_pcs=17`
Leiden baseline	`resolution=0.62`

3.2 空间可变基因

本分析在 3,000 个 HVG 上计算 Moran’s I，并按 Moran’s I 从高到低排序。Moran’s I 用于衡量表达值的空间自相关；数值越高，说明该基因越倾向于在空间上形成局部聚集。统计显著性通过 100 次 permutation 估计。

图 3 显示 Moran’s I 排名前 10 的空间可变基因。MBP、PLP1、MOBP、MAG 等 myelin/oligodendrocyte/WM 相关基因在 Moran’s I 排名中靠前，提示 WM 相关表达信号是本样本中较强的空间模式之一。这里的结果只能说明 RNA 表达在空间上的聚集趋势，不能直接解释为功能增强、功能缺失或调控机制变化。

表 4: Moran’s I 排名前 10 的基因

基因	Moran’s I	FDR
`MBP`	0.8075	<0.0001
`PLP1`	0.7019	<0.0001
`SCGB2A2`	0.7017	<0.0001
`MOBP`	0.6461	<0.0001
`GFAP`	0.6246	<0.0001
`TF`	0.5927	<0.0001
`CNP`	0.5717	<0.0001
`CRYAB`	0.5613	<0.0001
`MAG`	0.5459	<0.0001
`PPP1R14A`	0.5334	<0.0001

3.3 已知 marker 检查

为了检查空间表达结果是否与已知解剖结构方向一致，本项目查看了几个常用 marker。该检查属于结果合理性检查，不作为独立验证实验。

图 4 展示了 5 个参考 marker 的空间表达。MBP 和 MOBP 的高表达区域主要位于 WM；SNAP25 主要分布在皮层灰质区域。PCP4 在 Layer5 附近有表达，但空间自相关强度低于前几个 WM marker。RELN 在本分析中的 Moran’s I 排名较低。

表 5: 已知 marker 的空间表达检查

Marker	参考方向	空间表达观察	Moran’s I rank
`MBP`	WM / myelin / oligodendrocyte 相关	WM 区域信号较强	1
`MOBP`	WM / myelin / oligodendrocyte 相关	WM 区域信号较强	4
`SNAP25`	神经元 / gray matter 相关	gray matter 区域信号较强	20
`PCP4`	Layer5 相关	有一定 Layer5 相关趋势	67
`RELN`	Layer1 相关	空间自相关较弱	399

4 空间聚类方法对比

4.1 比较思路

本项目比较三类无监督聚类结果：Leiden 只使用表达 PCA/kNN 图；SpaGCN 在表达信息之外加入空间坐标和 H&E 图像；BayesSpace 使用表达 PCA 和 Visium spot 邻接结构。聚类结果不使用人工层注释进行训练或拟合。人工层注释仅作为 reference label，用于计算 ARI 和 NMI。

表 6: 聚类方法设置

方法	输入信息	参数设置	本分析中的作用
Leiden	表达 PCA/kNN 图	`resolution=0.62`	无空间信息的基准
SpaGCN	表达、空间坐标、H&E 图像	`beta=49`, `n_clusters=7`	空间图模型
BayesSpace	表达 PCA 与 Visium 邻接结构	`q=7`, `gamma=2`, `nrep=50,000`	空间先验模型

4.2 空间分布对比

图 5 对比了人工层注释、Leiden、SpaGCN 和 BayesSpace 的空间分布。BayesSpace 在本样本中保留了较清晰的局部连续结构；Leiden 主要反映表达相似性，局部空间连续性较弱；SpaGCN 在当前参数下也没有超过 Leiden。

4.3 定量评估

表 7: 聚类结果与人工层注释的一致性

方法	ARI	NMI
Leiden	0.3882	0.5009
SpaGCN	0.3163	0.4593
BayesSpace	0.5355	0.6729

在 sample 151673 和当前参数设置下，BayesSpace 的 ARI/NMI 最高。这个结果支持空间先验在该样本的层状结构识别中有帮助。SpaGCN 在本设置下低于 Leiden ，可能与参数选择、H&E 信息利用方式或平滑效应有关；本报告未做进一步验证，因此不把这一结果泛化为方法优劣结论。

5 参考映射与细胞类型空间趋势

5.1 参考数据与 Tangram 设置

Tangram 参考映射使用 human MTG snRNA-seq 数据。参考数据按 subclass_label 抽样，得到 10,743 个 nuclei，覆盖 24 个 subclass。该参考数据包含主要皮层神经元和胶质细胞类型；由于参考数据来自 MTG，而空间数据来自 DLPFC，脑区差异可能影响部分细胞类型得分的解释。

Tangram 在 mode='clusters' 下运行，使用 1,279 个 marker genes，density prior 设置为 rna_count_based，训练 500 epochs。本报告将 Tangram 输出解释为细胞类型得分的相对空间趋势，不解释为直接细胞计数。

表 8: Tangram 参考映射设置

项目	设置
参考数据	human MTG snRNA-seq
注释列	`subclass_label`
参考数据规模	10,743 nuclei
Subclass 数	24
训练基因	1,279 marker genes
Tangram mode	`clusters`
Density prior	`rna_count_based`
Epochs	500

5.2 Tangram 空间趋势

图 6 展示 4 个 cell type score 的空间分布。Oligodendrocyte 的高分区域主要位于 WM，L2/3 IT 的高分区域主要位于浅层皮层。L5 ET 在中间层附近有分布，但不呈现明确的 Layer5 特异模式；Astrocyte 的分布相对分散。

5.3 按专家层注释汇总

图 7 按人工层注释汇总 4 个 cell type score。Oligodendrocyte 在 WM 中最高，L2/3 IT 在 Layer2 和 Layer3 中较高。L5 ET 在 Layer3、Layer4 和 Layer5 均有分布，因此不写作明确的 Layer5 特异富集。

表 9: Tangram cell type score 的层间分布

细胞类型	层间分布	解释范围
`Oligodendrocyte`	WM 中最高	与 WM 相关信号一致
`L2/3 IT`	Layer2 和 Layer3 中较高	与浅层兴奋性神经元分布方向一致
`L5 ET`	Layer3、Layer4 和 Layer5 均有分布	不写作明确 Layer5 特异富集
`Astrocyte`	各层分布差异较小	不作为层特异结果解释

6 空间邻域分析

6.1 Neighborhood enrichment

Neighborhood enrichment 用于检查不同区域或 cluster 是否更倾向于与自身或相邻区域相连。这里分别对人工层注释和 BayesSpace cluster 计算邻域富集关系。

图 8: Ground truth neighborhood enrichment

图 8 和图 9 显示，人工层注释和 BayesSpace cluster 都呈现局部连续性。该结果可作为空间结构检查，但不能单独用于判断 BayesSpace 是否准确恢复层间边界。

6.2 Co-occurrence 与 Ripley’s L

Co-occurrence 分析用于观察指定层在不同距离尺度上的共现趋势。本项目查看了 Layer1、Layer3、Layer5 和 WM。

这些图用于补充检查层注释的空间组织。这里没有围绕共现曲线或 Ripley’s L 做额外统计检验，因此只作描述性结果使用。

图 10 展示不同层注释在不同距离尺度下的 Ripley’s L 曲线。曲线差异主要用于观察各层的空间聚集和范围差异，不单独作为聚类准确性的判断依据。

7 讨论

7.1 主要观察

本项目从 3,611 个带人工层注释的 spot 开始，QC 后保留 3,601 个 spot 和 16,567 个基因。空间可变基因分析显示，MBP、PLP1、MOBP、MAG 等 WM/少突胶质相关基因在 Moran’s I 排名中靠前，提示 WM 与 gray matter 的表达差异是该样本中较强的空间信号之一。

7.2 方法层面的结果

在 sample 151673、本参数和 ARI/NMI 指标下，BayesSpace 与人工层注释的一致性最高（ARI = 0.5355，NMI = 0.6729）。这一结果支持空间先验在本样本的层状结构识别中有帮助。

Tangram 参考映射中，Oligodendrocyte 的高分区域主要位于 WM，L2/3 IT 的高分区域主要位于浅层皮层。由于 Tangram 输出是基于参考映射得到的相对得分，故无法将其解释为真实细胞比例或功能机制。

7.3 局限性

本项目是单样本、公开数据、特定参数下的分析。聚类方法比较使用人工层注释作为参考标签，并将目标类数设置在 7 个专家区域附近，因此结果不应泛化为所有 DLPFC 样本或所有空间聚类任务。

RNA-level 表达趋势、Tangram 映射和 neighborhood 分析都属于计算层面的证据，不能直接说明功能改变、因果关系或调控机制。若要支持机制层面的结论，需要多样本复现、独立数据集验证或实验验证。

8 方法汇总

前文结果均基于同一套预处理对象。人工层注释只用于结果评估，不参与无监督聚类或 Tangram 映射。

表 10: 主要分析参数汇总

分析步骤	主要设置
数据输入	sample 151673；`filtered_feature_bc_matrix.h5`；人工层注释
QC	`min_counts >= 500`；`min_genes >= 200`；`pct_counts_mt < 30`；基因至少在 10 个 spot 中检出
预处理	`target_sum=10,000`；`log1p`；`seurat_v3` HVG；3,000 HVG
PCA/kNN	50 PCs；kNN 使用前 17 PCs
SVG	`Squidpy` Moran’s I；3,000 HVG；100 次 permutation
Leiden	`resolution=0.62`
SpaGCN	`beta=49`；`n_clusters=7`
BayesSpace	`q=7`；`gamma=2`；`nrep=50,000`
Tangram	human MTG snRNA-seq reference；10,743 nuclei；24 subclasses；1,279 marker genes；`mode='clusters'`；`rna_count_based`；500 epochs
评估指标	ARI；NMI；reference label 为人工层注释

9 计算环境

下表只列出本项目中直接使用或直接影响主要结果的软件，不列依赖项。

表 11: 本项目直接相关软件版本

软件	版本	用途
Python	3.12.13	Python 分析环境
R	4.5.3	BayesSpace 运行环境
`Scanpy`	1.12.1	数据读取、QC、归一化、PCA、Leiden
`Squidpy`	1.8.1	空间邻居图、Moran’s I、邻域分析
`SpaGCN`	1.2.7	空间聚类
`BayesSpace`	1.20.2	空间聚类
`Tangram`	1.0.4	snRNA-seq 参考映射
`scikit-learn`	1.8.0	ARI、NMI 等评估指标

10 参考文献

Maynard KR, et al. (2021). Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience, 24, 425–436.
Zhao E, et al. (2021). Spatial transcriptomics at subspot resolution with BayesSpace. Nature Biotechnology, 39, 1375–1384.
Hu J, et al. (2021). SpaGCN: Integrating gene expression, spatial location and histology to identify spatial domains and spatially variable genes by graph convolutional network. Nature Methods, 18, 1342–1351.
Biancalani T, et al. (2021). Deep learning and alignment of spatially resolved single-cell transcriptomes with Tangram. Nature Methods, 18, 1352–1362.
Palla G, et al. (2022). Squidpy: a scalable framework for spatial omics analysis. Nature Methods, 19, 171–178.